CRISPR/Cas9（成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列/CRISPR相關(guān)蛋白9）系統(tǒng)極大地促進了多種物種的體外和體內(nèi)基因抑制實驗。在細胞內(nèi)，Cas9核酸酶與引導(dǎo)RNA（gRNA）形成復(fù)合物，該復(fù)合物通過與基因組中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用提供靶向特異性。gRNA與靶位點通過互補配對使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因組中的靶位點。Cas9掃描基因組并切割與gRNA互補的序列，前提是這些序列跟隨著一段NGG前間區(qū)序列鄰近基序（PAM）。雙鏈DNA斷裂隨后被HDR或者NHEJ途徑修復(fù)，從而產(chǎn)生不同大小長度的位點突變（堿基插入或缺失）。

使用一個一體化的同時表達Cas9和gRNA的載體，或者分開表達Cas9和gRNA的載體，可以方便地在線蟲中進行CRISPR/Cas9編輯。該載體系統(tǒng)屬于后者，包含一個線蟲密碼子優(yōu)化的U6啟動子驅(qū)動表達的gRNA。該載體可以被注射到線蟲的遠端性腺，然后進入生殖細胞細胞核。使用該載體注射的線蟲可以表達Cas9。篩選突變后代，獲得突變可遺傳的基因敲除線蟲品系。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更新信息，請參考以下文獻。

通過在載體骨架上整合進人工合成的啟動子近側(cè)內(nèi)含子序列，我們的載體經(jīng)過優(yōu)化可以在線蟲中高效表達轉(zhuǎn)基因。

技術(shù)簡單：使用顯微注射即可把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞，相比起病毒載體需要進行病毒包裝，過程更簡單。.

靈活性：根據(jù)使用者的實驗需求，我們的線蟲gRNA表達載體可以搭配不同類型的Cas9使用。

基因拷貝數(shù)在不同細胞中呈現(xiàn)差異性：盡管成功的轉(zhuǎn)染可以在單個細胞里產(chǎn)生非常高的拷貝數(shù)，但不同細胞間卻有高度的差異性。在一些細胞中，質(zhì)粒拷貝數(shù)非常高，而在另外一些細胞卻是低拷貝甚至沒有。

PAM要求：CRISPR/Cas9靶位點必須包含NGG序列（使用較多），也叫做PAM序列，位于gRNA識別序列3'末端。 

CeU6: C. elegans U6 small nuclear RNA promoter. It drives strong expression levels of small RNAs.

gRNA: Guide RNA compatible with the Cas9 variant being used.

Terminator: Pol lll transcription terminator. It allows transcription termination of small RNA transcribed by Pol lll RNA polymerase.

Ampicillin:  Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori:   pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.